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| IHC信號微弱/無信號 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 抗體效力 | a. 抗體效價不高?？赏ㄟ^增加抗體使用濃度，延長抗體孵育時間進行調整。 b. 所用抗體不適用于IHC實驗。建議在非變性WB上測試該抗體，以確?？贵w識別非變性抗原，或是選用通過IHC實驗驗證的抗體。 c. 一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗。 d. 抗體失活。避免將標記熒光基團的二抗放置于光照環境。 |
| 酶底物失活或呈色時波長設置錯誤 | a. 顯色溶液失去作用，可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑，或底物緩沖液的pH值不適當。建議取一滴二抗標記酶與底物溶液反應, 可確認顯色溶液是否失去活性。 b. 錯誤的激發波長。呈色前確保激發波長與使用的熒光基團相匹配。 |
| 樣品制備問題 | a. 脫蠟作用不足。建議延長脫蠟時間，使用新鮮配制的二甲苯。 b. 固定液（福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復方式使表位暴露出來或縮短固定作用的時間。 c. 固定作用不適當。避免延遲固定或過度固定，一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數實驗應用。 d. 冰凍切片樣品保存期過長。冰凍切片制備完成后，最好于1-2個月內用完，超過6個月的話，建議制備新的玻片。 e. 熒光染色樣品保存不當。熒光基團在光線下暴露時間過長，可能會導致信號減弱，建議在避光環境下進行實驗和保存樣品，也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。 |
| 樣品屬性 | a. 靶蛋白含量低。建議設置為陽性対照組，增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號。 b. 靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑，以促進抗體滲透到細胞內。 c. 靶蛋白為膜蛋白而表位可能因為滲透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。 d. 較厚的組織。如斑馬魚全胚胎或染色建議做細胞破膜，以便抗體順利進入胞內與相應抗原結合。 關鍵步驟：在每次的實驗中，設置陽性與陰性對照組，以確認是該次實驗的抗體、試劑、組織切片、實驗過程的問題，還是靶蛋白自身表達量低的問題。 |
| IHC非特異性染色/背景值比較高 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 固定方式或組織自身可能存在自發熒光 | a. 嘗試用非醛類替代醛類。 b. 用淬滅自發熒光的染料或方法處理組織樣品：如短波長的UV照射、蘇丹黑等。 c. 將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片（OCT或明膠），減少固定液的影響。 d. 選擇不會與自發熒光競爭的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會產生高背景的熒光，尤其在使用綠色、藍色和紅色波長光譜范圍時；組織中的紅細胞或膠原蛋白等組分會產生很強的自發熒光，尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測時。 f. 使用福爾馬林或PFA固定過久。一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數實驗應用，注意：如固定時間到了無法繼續后續脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否則有可能造成蛋白交聯無法修復。 g. 配置新鮮的固定液 |
| 封閉、洗脫或顯色問題 | a. 增加封閉液濃度、延長封閉時間。 b. 更換封閉液成分，注意: 封閉液成分不可與一抗物種同來源，最好與二抗物種同源，如二抗來自馬血清，使用馬血清可得到較干凈的背景。 c. 底物過量：縮短底物孵育時間。 d. 信號過度放大：縮短信號放大試劑孵育時間。 e. 洗脫液不適合：如果原本是用PBS，可更換使用TBS |
| 抗體濃度太高或非特異性結合 | a. 降低抗體濃度，如1：100調整為1：1000。 b. 縮短抗體孵育時間，并在4°c 孵育。 c. 增加封閉緩沖液濃度。 d. 做多個目標蛋白染色時，建議使用預吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。 e. 針對二抗與組織發生非特異性結合的情況建議每次實驗都要設置一組不加一抗，只加二抗的對照組，才能確認信號是來自高背景值還是真實信號。 |
| 內源性酶（過氧化氫酶或堿性磷酸酶） | a. 使用酶抑制劑。 - 過氧化物酶：使用H2O2 (0.3% v/v) - 堿性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM) |
| 內源性生物素 | 與 Avidin 孵育以封閉生物素 |
| 組織問題 | a. 脫蠟不，可能導致細胞核染色在呈相時模糊，亦可能導致抗體無法辨認抗原或者高背景值。 b. 抗原修復方式不適合，建議更換修復溶液成分或方法。 c. 一抗與組織物種同源。較常發生在使用鼠源抗體染鼠源組織時，除了避開同樣物種來源的一抗和組織之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實驗。 d. 任何時候都不要讓組織干掉。 |
| IHC實驗結果形態不佳 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 組織切片從載玻片上脫落 | a. 使用新鮮配制、適當帶電或疏水處理過的載玻片。 b. 石蠟切片貼于載玻片后，于60°C烘烤3-5小時最為合適，烘烤不足容易掉片。 c. 實驗過程中要輕柔沖洗載玻片上的組織。 |
| 組織切片撕裂、褶皺或有氣泡 | a. 切片刀鈍或是刀刃上有缺口。建議使用鋒利刀片重新制備切片。 b. 刀刃上有蠟屑的積留，請隨時將廢屑殘渣用毛刷清除干凈。 c. 刀沒夾緊或刀的角度傾斜。適當調節切片刀的角度，并確認刀片和蠟塊都有夾緊。 d. 移動刀座，如果劃痕還是出現在相同位置，應該是組織標本內有污物或硬物的問題。 e. 確認組織無過度脫水，并調節適當切片速度。 f. 在分析實驗結果時，避免損壞切片區域。 g. 避免展片時于載玻片上形成的氣泡。 |
| 組織形態分辨率差 | a. 制備較薄的切片。一般來說，冰凍切片的片子較厚（約10-30 um），一般設定刀片溫度為-10~-20度，如設定溫度太低，可能會切不好；石蠟切片的片子較?。s5-10 um）。 b. 確認已使用適當厚度的蓋玻片，如使用油鏡一定要滴油。 c. 建議使用激光共聚焦顯微鏡成像，去除非焦點平面的噪質。 |
| 固定不或造成物理損傷 | a. 增加固定時間。如使用4 % PFA，一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數實驗應用，可依據染色結果增加固定時間與/或加入后固定的步驟。注：如固定時間到了無法繼續后續脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中。 b. 增加固定液/組織比例，建議固定液體積至少要是組織塊的20倍體積。 c. 準備較小的組織塊（約3-4 mm），以迸行更q的浸潤固定。 |
| 抗原修復過于強烈 | a. 憑經驗決定保留組織型態的條件，同時恢復抗原的免疫反應性。理論上溫度越高，酸堿值越堿，但可能造成較高的背景值或組織型態破壞，因此，建議從92°C, pH 6開始嘗試，pH 6的抗原修復液即適用于大多數抗體。 b. 使用冰凍切片樣本。冰凍切片一般不做抗原修復，因為抗原修復方式對冰凍切片可能太過強烈，也不需脫蠟、覆水等步驟，能夠較完好地保存細胞膜表面和細胞內多種酶活性以及抗原的免疫活性。 |
| 切片組織細胞形成冰晶 | a. 防止組織中冰晶形成： -速凍使組織溫度驟降, 減少冰晶的形成。 -固定后將組織置于20％～30％蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分, 減少組織含水量，可防止或減少冰晶的形成。 |
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